什么是 AOP
有害結(jié)局路徑（ Adverse outcome pathway, AOP）對(duì)毒理學(xué)家和化學(xué)品監(jiān)管員來(lái)說(shuō)是一個(gè)時(shí)髦的新概念，此概念發(fā)展于 2007年的 21世紀(jì)毒理學(xué)愿景，并于 2010年正式提出了 AOP的概念框架。雖然這個(gè)框架本身的定義與結(jié)構(gòu)是冗長(zhǎng)而復(fù)雜的，可以簡(jiǎn)述為“用以描述已有的關(guān)于一個(gè)直接的分子起始事件（ molecular initiating event, MIE）（如 :外源化合物與特定生物大分子的相互作用）與在生物不同組織結(jié)構(gòu)層次（如 :細(xì)胞、器官、機(jī)體、群體）所出現(xiàn)的與危險(xiǎn)度評(píng)定相關(guān)的 "有害結(jié)局 "之間的相互聯(lián)系”，但是實(shí)際上， AOP的提出以來(lái)極大的簡(jiǎn)化了化學(xué)品的毒性評(píng)估流程，并使得從毒性作用機(jī)制出發(fā)的化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)管理策略成為了可能。
AOP 最核心的內(nèi)容在于規(guī)范化和模塊化了從分子、細(xì)胞、組織、器官及至最終個(gè)體與群體水平的一系列毒性發(fā)生事件，并強(qiáng)調(diào)以邏輯推理性來(lái)確定這些毒性發(fā)生事件的前后關(guān)系。因?yàn)樵?AOP概念提出之前，毒理學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)是相對(duì)孤立的，例如離體（ in vitro）研究主要關(guān)注于分子與細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)，而活體（ in vivo）研究關(guān)注的重點(diǎn)則是在組織、器官及個(gè)體水平的有害損傷，造成這一現(xiàn)象的主要原因在于從分子至個(gè)體乃至群體水平的毒性發(fā)生的各個(gè)事件雖然相互交叉或前后關(guān)聯(lián)，但整體來(lái)看則缺乏必要的統(tǒng)一性。而在 AOP框架中，則要求采用證據(jù)權(quán)重（ weight of evidence, WoE）的方式評(píng)估數(shù)據(jù)，確定毒性發(fā)生的各個(gè)事件，強(qiáng)調(diào)不同毒性過(guò)程（如致癌和內(nèi)分泌干擾這兩種不同的毒性過(guò)程）中類似的毒性事件（如細(xì)胞增殖）的一致性；另一方面也采用 WoE的方式來(lái)關(guān)聯(lián)不同毒性事件發(fā)生的前后順序，強(qiáng)調(diào)從一個(gè)毒性事件推導(dǎo)至另一個(gè)毒性事件的邏輯性（如雌激素受體的激活導(dǎo)致的細(xì)胞增殖）。因此， AOP框架提出的即是以所謂的高內(nèi)聚低耦合的模塊化思想來(lái)完整拼出整個(gè)毒性發(fā)生過(guò)程。
AOP 中關(guān)鍵概念
類似于作用機(jī)制（ Mode of Action, MoA），一條典型的 AOP也是基于系統(tǒng)綜述研究數(shù)據(jù)后總結(jié)的，能夠用于描述毒性通路和作用模式，但相比于 MoA， AOP則更強(qiáng)調(diào)從分子至個(gè)體乃至種群水平的各個(gè)毒性事件的推演。其中，毒性事件可以具體分為分子起始事件（ Molecular Initiating Event, MIE），關(guān)鍵事件（ KeyEvents, KEs）和有害結(jié)局（ Adverse Outcome, AO）這三大類，而各個(gè)過(guò)程則是通過(guò)關(guān)鍵事件關(guān)系（ Key Event Relationships, KERs）進(jìn)行連接。
AOP 的概念可以類比于多米諾骨牌游戲，雖然 MIE、 KEs和 AO都屬于不同的事件，但它們之間發(fā)生的前后順序是不同的， MIE強(qiáng)調(diào)的是分子層面的起始事件，如受體蛋白的激活、 DNA損傷的發(fā)生等，因此 MIE的發(fā)生是整個(gè) AOP的起點(diǎn)，類似于推倒第一張多米諾骨牌。而 KE的發(fā)生則類似于其余骨牌接連倒下的連鎖反應(yīng)，隨著 MIE的激活后不同的 KEs序貫進(jìn)行，需要注意的是這些 KEs的發(fā)生的層次是從分子水平至個(gè)體或群體水平依次遞增的，如化合物暴露引起的某個(gè) MIE首先造成一系列的蛋白水平的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、隨后是細(xì)胞器的損傷、細(xì)胞的增殖或死亡、組織及器官損傷等，并最終關(guān)聯(lián)至 AOP的終點(diǎn) AO，如導(dǎo)致個(gè)體的損傷或死亡以及種群水平的改變等。而 KERs則決定了不同毒性事件前后的發(fā)生順序，以及由前一個(gè)毒性事件向下一個(gè)毒性事件發(fā)生的因果關(guān)系，而這種因果關(guān)系的判斷則來(lái)源于生物學(xué)關(guān)聯(lián)性、經(jīng)驗(yàn)判斷和定量分析三大方面。
整體而言，一條 AOP的建立確定了毒性發(fā)生過(guò)程中各個(gè)獨(dú)立的毒性事件（ MIE、 KEs和 AO），以及毒性事件發(fā)生間的前后關(guān)系（ KERs），從而將這些毒性事件模塊化，能夠應(yīng)用或發(fā)展其他的 AOP。正應(yīng)如此，隨著 AOP概念的發(fā)展， AOPWiki網(wǎng)站（ aopwiki.org）不僅收錄了已建立的或正在發(fā)展的兩百多條 AOP，而且還模塊化了眾多 KEs和 KERs，從而能夠基于這些 KEs和 KERs來(lái)進(jìn)一步完善或構(gòu)成其他 AOP。
AOP 的收益與應(yīng)用場(chǎng)景
不可否認(rèn)的是 AOP的概念及框架是復(fù)雜的，但實(shí)際上一條完整 AOP的建立能夠極大促進(jìn)毒理學(xué)研究和簡(jiǎn)化化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估流程。由于 AOP的建立主要是通過(guò) WoE的方式總結(jié)研究數(shù)據(jù)而建立的，對(duì)于已建立和認(rèn)可的 AOP來(lái)說(shuō)，這條 AOP中各個(gè)毒性事件是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后可識(shí)別或可檢測(cè)的，同時(shí)它們之間的發(fā)生是具有可靠的因果關(guān)系。當(dāng)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行毒理學(xué)研究或化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，我們僅需要對(duì)有限的已囊括于某條 AOP的毒性事件展開(kāi)試驗(yàn)即可推斷出最終的毒性損傷效應(yīng)，因而極大的減少了實(shí)驗(yàn)量。另一方面，由于 AOP的建立層次是從分子水平乃至個(gè)體或群體水平依次遞增的，且相互關(guān)聯(lián)，因此我們可以根據(jù)以建立的 AOP從低層次的（分子或細(xì)胞水平）毒性事件推斷出高層次的（器官、個(gè)體或種群水平）毒性事件，而用于檢測(cè)高層次的毒性事件的試驗(yàn)往往涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且費(fèi)用高周期長(zhǎng)，而低層次的毒性事則可以通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬（ in silico）和離體試驗(yàn)（ in vitro）進(jìn)行預(yù)測(cè)或檢測(cè)，費(fèi)用低且周期短，符合 3R原則。所以 AOP概念的建立在保證對(duì)化合物毒性評(píng)估的準(zhǔn)確性和可靠性的基礎(chǔ)上，減少了試驗(yàn)數(shù)量、周期和費(fèi)用，并進(jìn)一步保障了動(dòng)物福利。
正因如此， AOP的概念當(dāng)前已開(kāi)始應(yīng)用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)管評(píng)估、工業(yè)化學(xué)品的安全評(píng)估、新產(chǎn)品的發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)、醫(yī)藥衛(wèi)生與環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)等。而隨著歐盟內(nèi)分泌干擾物識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)配套導(dǎo)則（ Guidance for the identification of endocrine disruptor）在今年 6月的發(fā)布，針對(duì)于歐盟植物保護(hù)產(chǎn)品（ PPP）和歐盟消毒劑（ BPR）的內(nèi)分泌干擾評(píng)估已正式展開(kāi)，而在此指南文件中也首次采用 AOP的概念來(lái)對(duì)這些化學(xué)產(chǎn)品潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。
基于 AOP的歐盟植物保護(hù)產(chǎn)品（ PPP）內(nèi)分泌干擾評(píng)估
歐盟的內(nèi)分泌干擾識(shí)別導(dǎo)則中，針對(duì)于內(nèi)分泌干擾的評(píng)估分為兩個(gè)方面，首先是要根據(jù)廣泛收集和系統(tǒng)評(píng)估的研究數(shù)據(jù)，來(lái)判斷待評(píng)估的化合物是否同時(shí)具有內(nèi)分泌干擾活性（ endocrine activity）或與內(nèi)分泌干擾相關(guān)有害損傷（ adversity），然后再采用 AOP的概念來(lái)判斷由化合物引起的內(nèi)分泌干擾活性與有害損傷的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性（ biologicalplausibility）。而這種生物學(xué)關(guān)聯(lián)性分析是整個(gè)歐盟植物保護(hù)產(chǎn)品（ PPP）內(nèi)分泌干擾評(píng)估的重點(diǎn)和難點(diǎn)，針對(duì)于當(dāng)前已建立的一系列與內(nèi)分泌干擾相關(guān)的 AOP，導(dǎo)則中也已總結(jié)了相應(yīng)的符合 OECD GLP標(biāo)準(zhǔn)的不同層次的試驗(yàn)方法，從而在必要的情況下，可以根據(jù)有限的試驗(yàn)來(lái)完整的推斷化合物潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。而導(dǎo)則中也進(jìn)一步推薦根據(jù)已建立的 AOP，采用計(jì)算機(jī)模擬（ in silico）或離體試驗(yàn)（ in vitro）來(lái)獲取用于內(nèi)分泌干擾評(píng)估的數(shù)據(jù)。
以在 AOPwiki網(wǎng)站收錄的一條與內(nèi)分泌干擾相關(guān)的 AOP為例：由拮抗雌激素受體導(dǎo)致的生殖功能紊亂（ ID: AOP 30），該條 AOP當(dāng)前已基本建立完全，并已由 EAGMST展開(kāi)評(píng)估。此條 AOP關(guān)聯(lián)的是拮抗雌激素受體（ ID: MIE 112）的內(nèi)分泌干擾活性與引起魚(yú)類種群水平的降低有害損傷（ ID: AO 360），主要的關(guān)鍵事件依次包括降低肝中卵黃蛋白原的合成（ ID: KE285），降低血漿中卵黃蛋白原的濃度（ ID: KE 221），降低了卵母細(xì)胞中卵黃蛋白原的積累并影響卵母細(xì)胞的生殖 /發(fā)育（ ID: KE 309）和降低魚(yú)類的累積繁殖能力和產(chǎn)卵率（ ID: KE 78），這些毒性事件如圖所示也是通過(guò) KERs相互關(guān)聯(lián)的。
依據(jù)此 AOP，針對(duì)待測(cè)化合物的內(nèi)分泌干擾展開(kāi)評(píng)估，首先我們可以考慮計(jì)算機(jī)模擬或來(lái)源于高通量離體毒性數(shù)據(jù)庫(kù)的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行初步判斷，導(dǎo)則中推薦的方法是方式 ToxCast ER Bioactivity Model或者分子對(duì)接的 QSAR方法，若不存在數(shù)據(jù)也可以通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)（ OECD TG 455）評(píng)估化合物是否具有對(duì)雌激素受體具有拮抗作用，這些試驗(yàn)結(jié)果都可以用來(lái)支持待評(píng)估化合物是否能夠?qū)е略摋l AOP中的 MIE。而根據(jù)短期魚(yú)類繁殖試驗(yàn)（ OECD TG 229）可以進(jìn)一步獲取用于支持該條 AOP關(guān)鍵事件（ KEs），如卵黃蛋白的合成抑制、血漿中卵黃蛋白的濃度等。因此結(jié)合這兩部分試驗(yàn)結(jié)果與已建立的 AOP 30，我們可以在有限的試驗(yàn)基礎(chǔ)上充分判斷待評(píng)估的化合物是否具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。
總結(jié)
隨著農(nóng)藥等工業(yè)化學(xué)品在全球登記過(guò)程中的新趨勢(shì)， AOP框架的發(fā)展提高了針對(duì)于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的準(zhǔn)確性與可靠性，并進(jìn)一步的提倡 3R原則，保障動(dòng)物福利，減少不必要的試驗(yàn)和降低試驗(yàn)周期與費(fèi)用。針對(duì)這些新趨勢(shì)，華測(cè)瑞歐農(nóng)化和材料事業(yè)部技術(shù)團(tuán)隊(duì)，當(dāng)前已積累了深厚的技術(shù)儲(chǔ)備，已完成和進(jìn)行了多項(xiàng)基于 AOP的歐盟內(nèi)分泌效應(yīng)評(píng)估，如有任何疑問(wèn)歡迎隨時(shí)咨詢。
小知識(shí)試驗(yàn)動(dòng)物的 3R原則：
1 ． Reduction（減少）指在科學(xué)研究中，使用較少量的動(dòng)物獲取同樣多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)或使用—定數(shù)量的地動(dòng)物能獲得更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)方法。
2 ． RepIacement（替代）指使用其他方法而不用動(dòng)物所進(jìn)行的試驗(yàn)或其他研究課題，以達(dá)到某—試驗(yàn)?zāi)康??；蚴鞘褂脹](méi)有知覺(jué)的試驗(yàn)材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)的一種科學(xué)方法。
3 ． Refinement（優(yōu)化）指在符合科學(xué)原則的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)條件，善待動(dòng)物，提高動(dòng)物福利：或完善實(shí)驗(yàn)程序和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，避免或減輕給動(dòng)物造成的與實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒o(wú)關(guān)的疼痛和緊張不安的科學(xué)方法。
來(lái)源： 華測(cè)瑞歐
